domingo, 6 de dezembro de 2020

Os pesquisadores desenvolvem novos diagnósticos COVID-19 utilizando a plataforma de teste CRISPR e a câmera do smartphone

 

Fonte: COVID-19 Diagnostics 06 de dezembro de 2020

Diagnóstico COVID-19 : Pesquisadores do Gladstone Institutes, University of California, Berkeley (UC Berkeley) e University of California, San Francisco (UCSF) desenvolveram uma nova plataforma de diagnóstico COVID-19 rápida e portátil, porém precisa, utilizando a tecnologia de teste CRISPR e o câmera do smartphone.


O surto de coronavírus SARS-CoV-2 tornou-se uma pandemia global contínua devido em parte ao desafio de identificar portadores sintomáticos, assintomáticos e pré-sintomáticos do vírus.

 

Os testes baseados na tecnologia CRISPR podem aumentar os diagnósticos baseados em PCR padrão ouro se eles puderem ser rápidos, portáteis e precisos.

 

A equipe de estudo relata o desenvolvimento de um ensaio CRISPR-Cas13a sem amplificação para detecção direta de SARS-CoV2 a partir de RNA de swab nasal que pode ser lido com um microscópio de telefone móvel. O ensaio atingiu uma sensibilidade de ~ 100 cópias / µL em menos de 30 minutos do tempo de medição e detectou com precisão o RNA pré-extraído de um conjunto de amostras clínicas positivas em menos de 5 minutos.

 

A equipe combinou crRNAs visando SARS-CoV-2 RNA para melhorar a sensibilidade e especificidade, e quantificou diretamente a carga viral usando cinética enzimática. Integrado com um dispositivo de leitura baseado em um telefone celular, este ensaio tem o potencial de permitir uma triagem rápida e de baixo custo no local de atendimento para SARSCoV-2.

 

A pesquisa e o desenvolvimento foram publicados na revista peer review: Cell.https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(20)31623-8.pdf

 

O novo desenvolvimento permitiria que as pessoas limpassem suas narinas, colocando o cotonete em um dispositivo e obtendo uma leitura em seus telefones em 15 a 30 minutos, informando se eles estão infectados com o vírus COVID-19.

 

Esta tem sido a visão da equipe de pesquisa do estudo e agora, eles relatam um avanço científico que os aproxima de tornar essa visão uma realidade.

 

Até o momento, um dos principais obstáculos para combater a pandemia COVID-19 e reabrir totalmente as comunidades em todo o país é a disponibilidade de testes rápidos em massa. Saber quem está infectado forneceria informações valiosas sobre a potencial disseminação e ameaça do vírus para legisladores e cidadãos.

 

Atualmente, os indivíduos muitas vezes precisam esperar vários dias por seus resultados, ou até mais quando há um acúmulo no processamento de testes de laboratório. E, a situação é agravada pelo fato de que a maioria dos indivíduos infectados tem sintomas leves ou nenhum sintoma, mas ainda assim carrega e espalha o vírus SARS-CopV-2.

 

A equipe descreveu a tecnologia para um teste baseado em CRISPR para COVID-19 que usa uma câmera de smartphone para fornecer resultados precisos em menos de 30 minutos.

 

A Dra. Melanie Ott, MD, Ph.D., diretora do Gladstone Institute of Virology e um dos líderes do estudo disse: "Tem sido uma tarefa urgente para a comunidade científica não apenas aumentar os testes, mas também para fornecer novas opções de teste. O ensaio que desenvolvemos pode fornecer testes rápidos e de baixo custo para ajudar a controlar a disseminação de COVID-19. "

 

A nova plataforma de diagnóstico foi projetada em colaboração com o bioengenheiro da UC Berkeley, Dr. Daniel Fletcher, Ph.D., bem como a Dra. Jennifer Doudna, Ph.D., que é pesquisadora sênior de Gladstone, professor da UC Berkeley, presidente da o Innovative Genomics Institute e um investigador do Howard Hughes Medical Institute. O Dr. Doudna ganhou recentemente o Prêmio Nobel de Química de 2020 por co-descobrir a edição do genoma CRISPR-Cas, a tecnologia que está por trás deste trabalho. É importante ressaltar que não apenas seu novo teste de diagnóstico pode gerar um resultado positivo ou negativo, mas também mede a carga viral (ou a concentração de SARS-CoV-2, o vírus que causa COVID-19) em uma determinada amostra.)

 

 

 

 

 

O Dr. Fletcher acrescentou: "Quando combinada com testes repetidos, medir a carga viral pode ajudar a determinar se uma infecção está aumentando ou diminuindo. Monitorar o curso da infecção de um paciente pode ajudar os profissionais de saúde a estimar o estágio da infecção e prever, em tempo real, como muito provavelmente é necessário para a recuperação. "

 

Atualmente, os testes COVID-19 usam um método denominado PCR quantitativo, o padrão ouro de teste. No entanto, um dos problemas com o uso dessa técnica para testar o SARS-CoV-2 é que ela requer DNA. O coronavírus é um vírus de RNA, o que significa que, para usar a abordagem de PCR, o RNA viral deve primeiro ser convertido em DNA. Além disso, esta técnica depende de uma reação química em duas etapas, incluindo uma etapa de amplificação para fornecer DNA suficiente para torná-lo detectável.

 

Portanto, os testes atuais geralmente precisam de usuários treinados, reagentes especializados e equipamentos de laboratório pesados, o que limita severamente onde os testes podem ocorrer e causa atrasos no recebimento dos resultados.

 

No entanto, como alternativa ao PCR, os pesquisadores estão desenvolvendo estratégias de teste baseadas na tecnologia de edição de genes CRISPR, que se destaca na identificação específica de material genético.

 

Até o momento, todos os diagnósticos CRISPR também exigem que o RNA viral seja convertido em DNA e amplificado antes de ser detectado, aumentando o tempo e a complexidade. Em contraste, a nova abordagem descrita neste estudo recente ignora todas as etapas de conversão e amplificação, usando CRISPR para detectar diretamente o RNA viral.



Esquema de microscópio baseado em telefone móvel para detecção de fluorescência mostrando iluminação e componentes de coleta de imagem (esquerda). Imagem do dispositivo montado usado para coleta de dados e imagem de amostra tirada pela câmera do telefone celular após a execução de um ensaio Cas13a (direita).

 

O Dr. Doudna acrescentou: "Um dos motivos pelos quais estamos entusiasmados com os diagnósticos baseados em CRISPR é o potencial para resultados rápidos e precisos no ponto de necessidade. Isso é especialmente útil em locais com acesso limitado a testes ou quando testes rápidos e frequentes são necessários . Isso poderia eliminar muitos dos gargalos que vimos com o COVID-19. "

 

O Dr. Parinaz Fozouni, um estudante graduado da UCSF que trabalha no laboratório de Ott em Gladstone, tem trabalhado em um sistema de detecção de RNA para o HIV nos últimos anos. Mas em janeiro de 2020, quando ficou claro que o coronavírus estava se tornando um problema maior em todo o mundo e que o teste era uma armadilha em potencial, ela e seus colegas decidiram mudar seu foco para COVID-19.

 

O Dr. Fozouni, que é o co-autor do artigo, junto com o Dr. Sungmin Son e a Dra. María Díaz de León Derby da equipe do Dr. Fletcher na UC Berkeley, comentou: "Sabíamos que o ensaio que estávamos desenvolvendo seria uma escolha lógica para ajudar o ao permitir testes rápidos com recursos mínimos. Em vez da conhecida proteína CRISPR chamada Cas9, que reconhece e cliva DNA, usamos Cas13, que cliva RNA. "

 

Na nova plataforma de diagnóstico, a proteína Cas13 é combinada com uma molécula repórter que se torna fluorescente quando cortada e, em seguida, misturada com uma amostra de paciente de um esfregaço nasal. A amostra é colocada em um dispositivo que se conecta a um smartphone. Se a amostra contiver RNA do SARS-CoV-2, o Cas13 será ativado e cortará a molécula repórter, causando a emissão de um sinal fluorescente. Então, a câmera do smartphone, essencialmente convertida em um microscópio, pode detectar a fluorescência e relatar que um swab deu positivo para o vírus.

 

O Dr. Ott, que também é professor do Departamento de Medicina da UCSF, explicou: "O que realmente torna este teste único é que ele usa uma reação de uma etapa para testar diretamente o RNA viral, em oposição ao processo de duas etapas tradicional Testes de PCR. A química mais simples, combinada com a câmera do smartphone, reduz o tempo de detecção e não requer equipamentos de laboratório complexos. Também permite que o teste produza medições quantitativas em vez de simplesmente um resultado positivo ou negativo. "

 

A equipe também diz que seu ensaio pode ser adaptado a uma variedade de telefones celulares, tornando a tecnologia facilmente acessível.

 

O Dr. Fletcher explicou ainda: "Escolhemos usar telefones celulares como base para nosso dispositivo de detecção, pois eles têm interfaces de usuário intuitivas e câmeras altamente sensíveis que podemos usar para detectar fluorescência. Os telefones celulares também são produzidos em massa e são econômicos, demonstrando que instrumentos de laboratório especializados não são necessários para este ensaio. "

 

É importante ressaltar que quando os pesquisadores testaram seu dispositivo usando amostras de pacientes, eles confirmaram que ele poderia fornecer um tempo de resposta muito rápido de resultados para amostras com cargas virais clinicamente relevantes.

 

Na verdade, o dispositivo detectou com precisão um conjunto de amostras positivas em menos de 5 minutos. Para amostras com baixa carga viral, o dispositivo demorou até 30 minutos para diferenciá-lo de um teste negativo.

 

O Dr. Ott acrescentou: "Modelos recentes de SARS-CoV-2 sugerem que testes frequentes com um tempo de resposta rápido são o que precisamos para superar a pandemia atual. Esperamos que, com mais testes, possamos evitar bloqueios e proteger as populações mais vulneráveis. "

 

Significativamente, o novo teste baseado em CRISPR não só oferece uma opção promissora para teste rápido, mas ao usar um smartphone e evitar a necessidade de equipamentos de laboratório volumosos, ele tem o potencial de se tornar portátil e, eventualmente, ser disponibilizado para pontos de cuidados ou mesmo uso em casa. E também poderia ser expandido para diagnosticar outros vírus respiratórios além do SARS-CoV-2.

 

Além disso, a alta sensibilidade das câmeras dos smartphones, juntamente com sua conectividade, GPS e recursos de processamento de dados, tornaram-nas ferramentas atraentes para o diagnóstico de doenças em regiões de poucos recursos.

 

O Dr. Ott acrescentou: "Esperamos desenvolver nosso teste em um dispositivo que possa carregar resultados instantaneamente em sistemas baseados em nuvem, mantendo a privacidade do paciente, o que seria importante para rastreamento de contato e estudos epidemiológicos. Este tipo de teste de diagnóstico baseado em smartphone pode funcionar um papel crucial no controle das pandemias atuais e futuras. "

 

A equipe concluiu: “Embora demonstremos detecção rápida com sensibilidade razoável usando crRNAs com base em primers de PCR existentes, prevemos melhorias adicionais ao buscar sistematicamente as melhores combinações de crRNA em todo o genoma do RNA viral. À medida que mais informações se tornam disponíveis sobre as variantes virais, o desenho do crRNA pode ser adaptado para evitar falsos negativos. No entanto, embora a combinação de crRNAs melhore a sensibilidade, também oferece mais oportunidades para detecção fora do alvo não intencional, e cargas virais mais baixas podem ser registradas quando um crRNA na combinação não corresponde precisamente à sequência viral na amostra. Outras melhorias também são esperadas no repórter, na escolha das proteínas Cas13 e na sensibilidade do dispositivo e da câmera. Esses avanços podem melhorar a taxa de reação,

 

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