Fonte: COVID-19 Antivirals 05 de dezembro de 2020
COVID-19 Antivirais : Um novo estudo realizado por
pesquisadores da Stanford University-US, University Hospital
Heidelberg-Germany, University of Freiburg-Germany, German Cancer Research
Center (DKFZ) e o German Center for Infection Research (DZIF) indica que o
desenvolvimento de antivirais para tratar COVID-19 que são baseados na
abordagem de inibição de proteases SAR-COV-2 pode não ser uma forma eficaz
devido à presença de vias redundantes presentes em células hospedeiras humanas.
As duas principais proteases produzidas pelo vírus
SARS-CoV-2, Mpro e PLpro, são essenciais para a replicação viral e se tornaram
o foco de programas de desenvolvimento de medicamentos para o tratamento de
COVID-19.
A equipe de estudo examinou uma biblioteca altamente focada
de compostos contendo ogivas covalentes projetadas para alvejar proteases de
cisteína para identificar novos andaimes de chumbo para ambas as proteases Mpro
e PLpro. Esses esforços identificaram um pequeno número de ocorrências para a
protease Mpro e nenhuma ocorrência viável para a protease PLpro. Dos resultados
de Mpro identificados como inibidores da protease recombinante purificada,
apenas dois compostos inibiram a infecciosidade viral em ensaios de infecção
celular.
No entanto, a equipe do estudo observou uma queda
substancial na potência antiviral após a expressão de TMPRSS2, uma serina
protease transmembrana que atua em uma via alternativa de entrada viral para as
catepsinas lisossomais. Essa perda de potência é explicada pelo fato de que
esses inibidores principais de Mpro também são inibidores potentes das
cistepsinas de cisteína da célula hospedeira.
A fim de determinar se esta é uma propriedade geral dos
inibidores de Mpro, a equipe do estudo avaliou vários compostos relatados
recentemente e descobriu que eles também são inibidores eficazes das catepsinas
L e B humanas purificadas e mostraram perda semelhante de atividade em células
que expressam TMPRSS2.
Os resultados do estudo destacam os desafios de direcionar as
proteases Mpro e PLpro e demonstram a necessidade de avaliar cuidadosamente a
seletividade dos inibidores da protease SARS-CoV-2 para prevenir o avanço
clínico de compostos que funcionam através da inibição de uma via de entrada
viral redundante.
Os resultados da pesquisa foram publicados em um servidor de
pré-impressão e atualmente estão sendo revisados por pares.
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.11.21.392753v1
Como resultado da inexistência de drogas, terapêuticas e
vacinas eficazes para tratar COVID-19, os cientistas estão em uma busca
desesperada por antivirais eficazes para prevenir e tratar a infecção por
SARS-CoV-2 e têm investigado a possibilidade de inibir a principal protease
viral (Mpro ) e protease semelhante à papaína (PLpro), que são a chave para a
replicação do vírus. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27344959/
Vários compostos identificados que inibem essas enzimas ou
proteases foram descritos e estão avançando na via de desenvolvimento de
drogas.
Surpreendentemente, este novo estudo chama a atenção para as
grandes chances de que estes possam não ter atividade anti-infecciosa devido às
vias redundantes presentes nas células hospedeiras humanas.
As duas proteases principais são as proteases de cisteína,
codificadas como proteína não estrutural (nsp) 3 e nsp 5. Destas, a Mp ro é
autoclivada de uma grande poliproteína e então dimeriza para formar a proteína
funcional madura. Eles são obrigados a clivar a grande poliproteína viral em
suas várias partes funcionais para que ajudem a configurar o complexo de
transcrição-replicação próximo aos locais de montagem do vírus dentro das
células hospedeiras infectadas. Foi demonstrado que se um ou ambos são
inibidos, o RNA viral é suprimido e a infecção não pode ser estabelecida.
Vários inibidores de Mpro foram identificados, incluindo
compostos covalentes com ogivas eletrofílicas, e um deles entrou em testes
clínicos em humanos. O mesmo não é verdade para o PLpro porque
preferencialmente anexa grandes substratos de proteínas semelhantes à
ubiquitina. Assim, os melhores inibidores de PLpro parecem ser aqueles que se
ligam aos locais não enzimáticos que reconhecem a ubiquitina.
Problemas com inibidores Mpro / PLpro.
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.12.293498v2
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.29.068890v1
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ acsinfecdis.0c00168
Os inibidores de protease iniciais direcionados a outros
vírus de RNA têm sido difíceis de desenvolver e isso poderia prever obstáculos
semelhantes no caminho da tentativa atual.
Em primeiro lugar, a autoclivagem inicial de Mpro não é
facilmente evitada, dado o perfil de energia favorável da reação
intramolecular.
Além disso, o Mpro dimérico é agregado em locais específicos
no citosol ou nas superfícies da membrana perto da poliproteína viral. Assim,
os níveis de substrato são bastante elevados na proximidade da enzima, tornando
improvável a inibição competitiva.
Por último, muitas proteases virais tendem a manter seus
produtos de clivagem ligados aos locais de clivagem do substrato. Isso
significa que eles demoram a se ligar ao inibidor, a menos que o substrato
clivado seja primeiro deslocado - denominado inibição do produto. E o Mpro tem
um sítio ativo onde um inibidor pode atuar somente após a formação de seu
monômero, tornando impossível evitar essa etapa.
A equipe do estudo aponta que os únicos inibidores possíveis
são aqueles que são altamente biodisponíveis e podem atingir concentrações
locais altas o suficiente para inibir competitivamente os substratos originais
e, assim, atingir a inibição precoce antes que a replicação ativa comece.
É importante ressaltar que os inibidores de protease tendem
a se ligar a qualquer protease hospedeira com uma faixa de substrato
preferencial semelhante.
A redundância das vias enzimáticas na célula hospedeira é
outro desafio importante. Uma variedade de sistemas celulares é usada para
estudar esses inibidores de chumbo, o que significa que eles expressam várias
proteases em níveis diferentes.
Por exemplo, muitas proteases podem realizar a clivagem da
proteína S de SARS-CoV-2 para facilitar a fusão viral, incluindo cisteína
catepsinas B e L e TMPRSS2. Todos estes estão presentes em níveis elevados nas
células pulmonares, mas a sua expressão nas linhas celulares experimentais
varia.
Isso implica que ninguém sabe ao certo qual tipo de célula é
realmente o reflexo mais preciso do local primário de infecção em um hospedeiro
vivo, e que pode não ser possível atingir qualquer um deles isoladamente, já que
os outros fornecem uma via de escape.
A equipe de estudo na pesquisa atual selecionou seis
compostos covalentes portadores de ogivas eletrofílicas que inibem a Mpro
recombinante de uma forma dependente do tempo, entre cerca de 650 moléculas que
têm como alvo os resíduos de cisteína em Mpro e PLpro.
A equipe não conseguiu encontrar nenhuma pista para o
desenvolvimento do inibidor PLpro, talvez devido à gama muito estreita de
substratos adequados.
Verificou-se que dois dos seis pareciam ter atividade
antiviral pela inibição de Mpro na linha de células A549 de adenocarcinoma de
pulmão modificado. Há uma diferença significativa na potência nos testes de
infecção celular em comparação com os
testes in vitro , devido ao efeito da captação celular e à necessidade
de inibir completamente o Mpro dentro da célula hospedeira.
Mas quando testado em células que expressam TMPRSS2, sua
potência observada caiu drasticamente. O vírus conseguiu entrar na célula
hospedeira via TMPRSS2, indicando que o suposto inibidor de Mpro na verdade só
conseguiu inibir a catepsina. Esta atividade foi posteriormente confirmada.
Conseqüentemente, esses compostos principais assemelham-se a
inibidores da cisteína catepsina conhecidos e muitos inibidores de Mpro foram
relatados anteriormente, que também foram considerados inibidores das
catepsinas em concentrações nanomolares.
A equipe do estudo enfatiza que embora muitos inibidores
potenciais de Mpro e PLpro estejam sendo explorados para o tratamento da
infecção por SARS-CoV-2, é importante garantir que esses compostos sejam
realmente seletivos para esses alvos enzimáticos, em vez de inibidores para
outras vias celulares redundantes .
Por exemplo, o rupintrivir, um suposto inibidor da Mpro, é
um inibidor da catepsina L altamente potente, e isso é responsável pela atividade
antiviral observada.
Além disso, a inibição da replicação viral não é um
substituto para a inibição seletiva da enzima alvo, uma vez que a primeira
também pode ocorrer por outras vias. Este último deve ser confirmado
diretamente antes que uma molécula líder possa ser considerada como tendo a
eficácia desejada. A capacidade de inibir a catálise de um substrato de Mpro,
ou de marcar a enzima Mpro ativa, é uma métrica muito recente para avaliar a
atividade de Mpro dentro de uma célula, na verdade.
Por fim, as linhagens celulares devem ser selecionadas de
forma adequada para testar a atividade antiviral de modo a permitir a
identificação de inibidores que atuam por meio de vias de entrada viral
redundantes.
A equipe do estudo comentou: “Em conclusão, a inibição das
proteases Mpro e PLpro é considerada uma estratégia terapêutica potencialmente
viável para o tratamento de COVID-19. No entanto, como os modelos animais de
infecção por SARS-CoV-2 ainda estão sendo otimizados e a controvérsia permanece
sobre os sistemas celulares que imitam com mais precisão os aspectos da
infecção humana (provavelmente incluindo as vias de entrada viral), será
fundamental avaliar os parâmetros-chave da seletividade do alvo de drogas
conduzidas antes dos testes clínicos em humanos. Além disso, a variabilidade
dentro dos sistemas celulares usados para testes antivirais pode levar a
conclusões errôneas sobre a eficácia do candidato a líder. A maioria das
abordagens atuais usa apenas a inibição da replicação viral como uma métrica
para a eficácia das moléculas principais, sem qualquer confirmação direta da
inibição do alvo. Apenas recentemente, foi estabelecida a inibição do
processamento de um substrato Mpro geneticamente expresso ou a marcação da
enzima Mpro ativa como uma medida da atividade Mpro nas células. Neste
trabalho, descrevemos nossos esforços para rastrear uma biblioteca de
aproximadamente 650 diferentes arcabouços de inibidores covalentes contra as
duas proteases de cisteína SARS-CoV-2 primárias, Mpro e PLpro. Não conseguimos
identificar quaisquer inibidores de PLpro e, finalmente, encontramos apenas
dois inibidores de Mpro que exerceram atividade antiviral em modelos de
infecção celular, mas apenas em concentrações relativamente altas. No entanto,
descobrimos que a atividade antiviral dessas moléculas principais, bem como de
vários inibidores de Mpro relatados anteriormente, estava relacionada à sua
capacidade de inibir catepsinas do hospedeiro, destacando assim a importância
de compreender a seletividade do composto e verificar o envolvimento do alvo.
Tomados em conjunto, nossos resultados apontam os desafios para o
desenvolvimento de inibidores de proteases SARS-CoV-2 e sugerem que o uso de
linhas celulares estrategicamente escolhidas para testes antivirais pode ajudar
a prevenir a seleção de compostos cujos mecanismos de ação podem ser facilmente
superados por vias de entrada viral redundantes. Acreditamos fortemente que
nossas descobertas são de particular importância à luz dos medicamentos
amplamente sugeridos para avanço em ensaios clínicos, como o rupintrivir, ou
mesmo que entraram em ensaios clínicos como K11777 (Selva Therapeutics) e
PF-07304814. ”
https://www.nature.com/articles/s41589-020-00689-z
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.15.275891v2
https://www.nature.com/articles/s41422 -020-0356-z
https://www.nature.com/articles/s41467-020-19055-7
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