sábado, 5 de dezembro de 2020

COVID-19 Antivirais: Estudo mostra que o desenvolvimento de antivirais que se baseiam na abordagem de inibir as proteases SAR-CoV-2 pode não ser eficaz

 Fonte: COVID-19 Antivirals 05 de dezembro de 2020

COVID-19 Antivirais : Um novo estudo realizado por pesquisadores da Stanford University-US, University Hospital Heidelberg-Germany, University of Freiburg-Germany, German Cancer Research Center (DKFZ) e o German Center for Infection Research (DZIF) indica que o desenvolvimento de antivirais para tratar COVID-19 que são baseados na abordagem de inibição de proteases SAR-COV-2 pode não ser uma forma eficaz devido à presença de vias redundantes presentes em células hospedeiras humanas.


As duas principais proteases produzidas pelo vírus SARS-CoV-2, Mpro e PLpro, são essenciais para a replicação viral e se tornaram o foco de programas de desenvolvimento de medicamentos para o tratamento de COVID-19.

 

A equipe de estudo examinou uma biblioteca altamente focada de compostos contendo ogivas covalentes projetadas para alvejar proteases de cisteína para identificar novos andaimes de chumbo para ambas as proteases Mpro e PLpro. Esses esforços identificaram um pequeno número de ocorrências para a protease Mpro e nenhuma ocorrência viável para a protease PLpro. Dos resultados de Mpro identificados como inibidores da protease recombinante purificada, apenas dois compostos inibiram a infecciosidade viral em ensaios de infecção celular.

 

No entanto, a equipe do estudo observou uma queda substancial na potência antiviral após a expressão de TMPRSS2, uma serina protease transmembrana que atua em uma via alternativa de entrada viral para as catepsinas lisossomais. Essa perda de potência é explicada pelo fato de que esses inibidores principais de Mpro também são inibidores potentes das cistepsinas de cisteína da célula hospedeira.

 

A fim de determinar se esta é uma propriedade geral dos inibidores de Mpro, a equipe do estudo avaliou vários compostos relatados recentemente e descobriu que eles também são inibidores eficazes das catepsinas L e B humanas purificadas e mostraram perda semelhante de atividade em células que expressam TMPRSS2.

 

Os resultados do estudo destacam os desafios de direcionar as proteases Mpro e PLpro e demonstram a necessidade de avaliar cuidadosamente a seletividade dos inibidores da protease SARS-CoV-2 para prevenir o avanço clínico de compostos que funcionam através da inibição de uma via de entrada viral redundante.

 

Os resultados da pesquisa foram publicados em um servidor de pré-impressão e atualmente estão sendo revisados ​​por pares. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.11.21.392753v1

 

Como resultado da inexistência de drogas, terapêuticas e vacinas eficazes para tratar COVID-19, os cientistas estão em uma busca desesperada por antivirais eficazes para prevenir e tratar a infecção por SARS-CoV-2 e têm investigado a possibilidade de inibir a principal protease viral (Mpro ) e protease semelhante à papaína (PLpro), que são a chave para a replicação do vírus. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27344959/

 

Vários compostos identificados que inibem essas enzimas ou proteases foram descritos e estão avançando na via de desenvolvimento de drogas.

 

Surpreendentemente, este novo estudo chama a atenção para as grandes chances de que estes possam não ter atividade anti-infecciosa devido às vias redundantes presentes nas células hospedeiras humanas.

 

As duas proteases principais são as proteases de cisteína, codificadas como proteína não estrutural (nsp) 3 e nsp 5. Destas, a Mp ro é autoclivada de uma grande poliproteína e então dimeriza para formar a proteína funcional madura. Eles são obrigados a clivar a grande poliproteína viral em suas várias partes funcionais para que ajudem a configurar o complexo de transcrição-replicação próximo aos locais de montagem do vírus dentro das células hospedeiras infectadas. Foi demonstrado que se um ou ambos são inibidos, o RNA viral é suprimido e a infecção não pode ser estabelecida.

 

 

 

Vários inibidores de Mpro foram identificados, incluindo compostos covalentes com ogivas eletrofílicas, e um deles entrou em testes clínicos em humanos. O mesmo não é verdade para o PLpro porque preferencialmente anexa grandes substratos de proteínas semelhantes à ubiquitina. Assim, os melhores inibidores de PLpro parecem ser aqueles que se ligam aos locais não enzimáticos que reconhecem a ubiquitina.

Problemas com inibidores Mpro / PLpro. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.12.293498v2

 

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.29.068890v1

 

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ acsinfecdis.0c00168

 

 

Os inibidores de protease iniciais direcionados a outros vírus de RNA têm sido difíceis de desenvolver e isso poderia prever obstáculos semelhantes no caminho da tentativa atual.

 

Em primeiro lugar, a autoclivagem inicial de Mpro não é facilmente evitada, dado o perfil de energia favorável da reação intramolecular.

 

Além disso, o Mpro dimérico é agregado em locais específicos no citosol ou nas superfícies da membrana perto da poliproteína viral. Assim, os níveis de substrato são bastante elevados na proximidade da enzima, tornando improvável a inibição competitiva.

 

Por último, muitas proteases virais tendem a manter seus produtos de clivagem ligados aos locais de clivagem do substrato. Isso significa que eles demoram a se ligar ao inibidor, a menos que o substrato clivado seja primeiro deslocado - denominado inibição do produto. E o Mpro tem um sítio ativo onde um inibidor pode atuar somente após a formação de seu monômero, tornando impossível evitar essa etapa.

 

A equipe do estudo aponta que os únicos inibidores possíveis são aqueles que são altamente biodisponíveis e podem atingir concentrações locais altas o suficiente para inibir competitivamente os substratos originais e, assim, atingir a inibição precoce antes que a replicação ativa comece.

 

É importante ressaltar que os inibidores de protease tendem a se ligar a qualquer protease hospedeira com uma faixa de substrato preferencial semelhante.

 

A redundância das vias enzimáticas na célula hospedeira é outro desafio importante. Uma variedade de sistemas celulares é usada para estudar esses inibidores de chumbo, o que significa que eles expressam várias proteases em níveis diferentes.

 

Por exemplo, muitas proteases podem realizar a clivagem da proteína S de SARS-CoV-2 para facilitar a fusão viral, incluindo cisteína catepsinas B e L e TMPRSS2. Todos estes estão presentes em níveis elevados nas células pulmonares, mas a sua expressão nas linhas celulares experimentais varia.

 

Isso implica que ninguém sabe ao certo qual tipo de célula é realmente o reflexo mais preciso do local primário de infecção em um hospedeiro vivo, e que pode não ser possível atingir qualquer um deles isoladamente, já que os outros fornecem uma via de escape.

 

A equipe de estudo na pesquisa atual selecionou seis compostos covalentes portadores de ogivas eletrofílicas que inibem a Mpro recombinante de uma forma dependente do tempo, entre cerca de 650 moléculas que têm como alvo os resíduos de cisteína em Mpro e PLpro.

 

A equipe não conseguiu encontrar nenhuma pista para o desenvolvimento do inibidor PLpro, talvez devido à gama muito estreita de substratos adequados.

 

Verificou-se que dois dos seis pareciam ter atividade antiviral pela inibição de Mpro na linha de células A549 de adenocarcinoma de pulmão modificado. Há uma diferença significativa na potência nos testes de infecção celular em comparação com os   testes in vitro , devido ao efeito da captação celular e à necessidade de inibir completamente o Mpro dentro da célula hospedeira.

 

Mas quando testado em células que expressam TMPRSS2, sua potência observada caiu drasticamente. O vírus conseguiu entrar na célula hospedeira via TMPRSS2, indicando que o suposto inibidor de Mpro na verdade só conseguiu inibir a catepsina. Esta atividade foi posteriormente confirmada.

 

Conseqüentemente, esses compostos principais assemelham-se a inibidores da cisteína catepsina conhecidos e muitos inibidores de Mpro foram relatados anteriormente, que também foram considerados inibidores das catepsinas em concentrações nanomolares.

 

A equipe do estudo enfatiza que embora muitos inibidores potenciais de Mpro e PLpro estejam sendo explorados para o tratamento da infecção por SARS-CoV-2, é importante garantir que esses compostos sejam realmente seletivos para esses alvos enzimáticos, em vez de inibidores para outras vias celulares redundantes .

 

Por exemplo, o rupintrivir, um suposto inibidor da Mpro, é um inibidor da catepsina L altamente potente, e isso é responsável pela atividade antiviral observada.

 

Além disso, a inibição da replicação viral não é um substituto para a inibição seletiva da enzima alvo, uma vez que a primeira também pode ocorrer por outras vias. Este último deve ser confirmado diretamente antes que uma molécula líder possa ser considerada como tendo a eficácia desejada. A capacidade de inibir a catálise de um substrato de Mpro, ou de marcar a enzima Mpro ativa, é uma métrica muito recente para avaliar a atividade de Mpro dentro de uma célula, na verdade.

 

Por fim, as linhagens celulares devem ser selecionadas de forma adequada para testar a atividade antiviral de modo a permitir a identificação de inibidores que atuam por meio de vias de entrada viral redundantes.

 

A equipe do estudo comentou: “Em conclusão, a inibição das proteases Mpro e PLpro é considerada uma estratégia terapêutica potencialmente viável para o tratamento de COVID-19. No entanto, como os modelos animais de infecção por SARS-CoV-2 ainda estão sendo otimizados e a controvérsia permanece sobre os sistemas celulares que imitam com mais precisão os aspectos da infecção humana (provavelmente incluindo as vias de entrada viral), será fundamental avaliar os parâmetros-chave da seletividade do alvo de drogas conduzidas antes dos testes clínicos em humanos. Além disso, a variabilidade dentro dos sistemas celulares usados ​​para testes antivirais pode levar a conclusões errôneas sobre a eficácia do candidato a líder. A maioria das abordagens atuais usa apenas a inibição da replicação viral como uma métrica para a eficácia das moléculas principais, sem qualquer confirmação direta da inibição do alvo. Apenas recentemente, foi estabelecida a inibição do processamento de um substrato Mpro geneticamente expresso ou a marcação da enzima Mpro ativa como uma medida da atividade Mpro nas células. Neste trabalho, descrevemos nossos esforços para rastrear uma biblioteca de aproximadamente 650 diferentes arcabouços de inibidores covalentes contra as duas proteases de cisteína SARS-CoV-2 primárias, Mpro e PLpro. Não conseguimos identificar quaisquer inibidores de PLpro e, finalmente, encontramos apenas dois inibidores de Mpro que exerceram atividade antiviral em modelos de infecção celular, mas apenas em concentrações relativamente altas. No entanto, descobrimos que a atividade antiviral dessas moléculas principais, bem como de vários inibidores de Mpro relatados anteriormente, estava relacionada à sua capacidade de inibir catepsinas do hospedeiro, destacando assim a importância de compreender a seletividade do composto e verificar o envolvimento do alvo. Tomados em conjunto, nossos resultados apontam os desafios para o desenvolvimento de inibidores de proteases SARS-CoV-2 e sugerem que o uso de linhas celulares estrategicamente escolhidas para testes antivirais pode ajudar a prevenir a seleção de compostos cujos mecanismos de ação podem ser facilmente superados por vias de entrada viral redundantes. Acreditamos fortemente que nossas descobertas são de particular importância à luz dos medicamentos amplamente sugeridos para avanço em ensaios clínicos, como o rupintrivir, ou mesmo que entraram em ensaios clínicos como K11777 (Selva Therapeutics) e PF-07304814. ”

 

https://www.nature.com/articles/s41589-020-00689-z

 

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.15.275891v2

 

https://www.nature.com/articles/s41422 -020-0356-z

 

https://www.nature.com/articles/s41467-020-19055-7

 

Para obter mais informações sobre COVID-19 Antivirais , continue acessando.

 

 

 



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