quarta-feira, 11 de novembro de 2020

QUEBRA! Mutações SARS-CoV-2: Washington University, Mayo e Harvard Scientist Identificam Novas 48 Mutações SARS-CoV-2 RBD Resistentes a Anticorpos!

 Fonte: SARS-CoV-2 Mutations, 11 de novembro de 2020,

SARS-CoV-2 Mutations : Researchers of Washington University-St. Louis, Harvard Medical School e Mayo Clinic em um novo estudo usando uma variedade de anticorpos monoclonais (mAbs) para entender o panorama mutacional de resistência nos domínios de ligação ao receptor (RBD) SARS-CoV-2 descobriram 48 novas mutações resistentes a anticorpos incluindo 27 que estão circulando em humanos.



Mais preocupante é o fato de que cerca de 86% de todos os isolados das cepas D614G que são atualmente mais prevalentes, foram encontrados para ter essas mutações resistentes a anticorpos.

 

Essas mutações recém-descobertas podem ter implicações enormes nos desenvolvimentos terapêuticos de vacinas e anticorpos em andamento e também estão emitindo sinais de alerta sobre o protocolo monoclonal recentemente aprovado pelo FDA dos EUA e também todos os protocolos de tratamento de anticorpos monoclonais ou coquetéis futuros.

 

No estudo, a mutação mais preocupante foi o E484, pois era para ser resistente à neutralização pela maioria dos soros. Outra mutação que também causou preocupação foi a mutação S477, especialmente as cepas emergentes S477N.

 

Embora os anticorpos neutralizantes contra a proteína spike (S) SARS-CoV-2 sejam um objetivo da maioria das vacinas COVID-19 e estejam sendo desenvolvidos como terapêutica, as mutações de escape podem comprometer tais contramedidas. Para definir a paisagem mutacional imunomediada na proteína S, a equipe do estudo usou um vírus quimérico VSV-eGFP-SARS-CoV-2-S e 19 anticorpos monoclonais neutralizantes (mAbs) contra o domínio de ligação ao receptor (RBD) para gerar 48 escape mutantes. Essas variantes foram mapeadas na estrutura RBD e avaliadas quanto à resistência cruzada por plasma humano convalescente. Embora cada mAb tivesse perfis de resistência únicos, muitos resíduos compartilhados dentro de um epítopo, como várias variantes eram resistentes a vários mAbs. Notavelmente, identificamos mutantes que escaparam da neutralização por soros humanos convalescentes, sugerindo que alguns humanos induzem um repertório estreito de anticorpos neutralizantes. Ao comparar a paisagem mutacional mediada por anticorpos na proteína S com a variação de sequência nas cepas circulantes de SARS-CoV-2, identificamos substituições de aminoácidos individuais que poderiam atenuar as respostas imunológicas neutralizantes em alguns humanos.

 

Os resultados do estudo foram publicados em um servidor de pré-impressão e atualmente estão sendo revisados por pares. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.11.06.372037v1

 

Utilizando um conjunto de diferentes anticorpos monoclonais, a equipe do estudo determinou diferentes mutações na proteína spike SARS-CoV-2 que leva à resistência. Compreender essas mutações resistentes é importante no desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes.

 

O coronavírus SARS-CoV-2, responsável pela pandemia de COVID-19, infecta as células do hospedeiro por meio das proteínas de pico na superfície do vírus. A subunidade N-terminal (S1) desempenha um papel na ligação do receptor e a subunidade C-terminal (S2) ajuda na fusão da membrana da célula hospedeira-vírus.

 

Verificou-se que os domínios de ligação ao receptor (RBDs) de S1 se ligam à enzima conversora de angiotensina humana 2 (ACE2). Os anticorpos SARS-CoV-2 previnem a infecção alvejando o RBD.

 

Há muito se sabe que os vírus de RNA, como o SARS-CoV-2, estão presentes como um enxame de sequências genômicas em torno de uma sequência central. As variantes podem escapar desse enxame na presença de anticorpos ou drogas e se tornarem resistentes. No momento, existem mais de 2.700 mutações identificadas na proteína spike do vírus SARS-CoV-2. Pode haver vários mecanismos para essas mutações, como adaptação do hospedeiro e seleção imune durante a infecção natural.

 

 

 

É importante notar que mutantes adicionais podem surgir com o uso de vacinas, anticorpos terapêuticos e terapia de plasma convalescente, o que pode reduzir a eficácia dessas terapias.

 

Na verdade, na atual pandemia, acreditamos fortemente na hipótese de que muitas das mutações resistentes a anticorpos emergentes estão surgindo como resultado do uso incorreto de protocolos de plasma convalescentes usados por pesquisadores e profissionais médicos ignorantes e também a introdução de monoclonais e protocolos de anticorpos de coquetéis por empresas gananciosas de biotecnologia. (A maioria está provando ser ineficaz no tratamento de COVID-19 e está apenas contribuindo para a resistência crescente, para não mencionar os perigos futuros do realce dependente de anticorpos ADE ) Também acreditamos firmemente que a maioria das vacinas em desenvolvimento, uma vez introduzidas às massas, sairá pela culatra, conforme a pandemia assume uma nova dimensão e cinética com o crescente surgimento de mais variantes e mutações e o aumento de reinfecções, coinfecções e 'zoonoses infecções nas costas '.

 

Neste estudo, a equipe de estudo usou um vírus de estomatite vesicular infecciosa quimérica (VSV), um mimetizador de SARS-CoV-2, onde substituiu a glicoproteína pela proteína spike SARS-CoV-2. Usando o mAb 2B04, a equipe determinou que as variantes do SARS-CoV-2 que não foram neutralizadas tinham mutações no RBD relacionadas aos resíduos envolvidos na ligação do ACE2.



Isolamento do mutante de escape VSV-SARS-CoV-2. (A) Esboço do experimento de seleção de mutantes de escape. 2B04 e um mAb anti-influenza de controle foram testados quanto à atividade neutralizante contra VSV-SARS-CoV-2. A concentração de 2B04 adicionado na sobreposição inibiu completamente a infecção viral (painel do meio). Os dados são representativos de dois experimentos independentes. Os ensaios de placa foram realizados para isolar o mutante de escape VSV-SARS-CoV-2 em células Vero E6 TMPRSS2 (seta vermelha indicada). Ensaios de placa com 2B04 na sobreposição (placa inferior no painel direito); ensaios de placa sem Ab na sobreposição (placa superior no painel direito). Os dados são imagens representativas de três experimentos independentes. (B) Esquemático do gene S, que foi submetido a sequenciamento Sanger para identificar mutações (painel esquerdo). Para validação, cada VSV SARS-CoV-2 mutante foi testado em ensaios de placa com ou sem 2BO4 na sobreposição em células Vero (painel direito). Imagens representativas de dois experimentos independentes são mostradas.


Testes detalhados com outros nove mAbs revelaram um resultado semelhante. Para o mAb 2H04, as mutações de resistência estavam presentes fora do sítio de ligação ACE2, na lateral e na base do RBD. Isso sugere que a neutralização do vírus pode ocorrer por fatores de ligação alternativos.

 

É importante ressaltar que várias mutações de resistência eram comuns entre os diferentes mAbs testados, sugerindo que eles representam locais antigênicos importantes no RBD.

 

Curiosamente, as mutações de resistência decorrentes dos diferentes mAbs tornaram-nos resistentes a outros mAbs no conjunto de mAbs escolhido. As substituições em S477 e E484 levaram a uma ampla resistência, enquanto as substituições em vários outros locais levaram à resistência a mais de um mAb.

 

Outras mutações preocupantes incluíram F486S, T345, R346, K444, G446, 156 N450, L452, T478, F486 e P499, pois cada um estava associado a resistência a mais de um mAb.

 

Também os receptores ACE2 humanos solúveis, que não estão ligados às células e podem competir com os da célula hospedeira para se ligar ao vírus, são outra estratégia que está sendo investigada para combater o vírus. A equipe de estudo testou a resistência das células Vero E6 a ACE2 solúvel em humanos e murinos. O ACE2 solúvel humano neutralizou todos os mutantes de escape, embora algumas mutações exigissem concentrações de ACE2 mais altas para serem neutralizados. Vários mutantes exigiram concentrações mais altas (3-5 vezes) de hACE2 para bloquear a infecção, incluindo substituições em T345A, T345N, G446D, G446V, E484D e F486Y.

 

A equipe do estudo também usou soro de quatro pacientes convalescentes com COVID-19 para testar se os anticorpos séricos neutralizavam os vírus mutantes de escape. Eles encontraram muitas mutações que eram resistentes à neutralização pelo soro. Em particular, a mutação no resíduo E484 era resistente a todos os quatro soros, sugerindo que este é um epítopo neutralizante principal. No entanto, a substituição nesta posição foi bastante rara e encontrada apenas em cerca de 0,05% das cepas sequenciadas.

 

A equipe de estudo também testou mutações adicionais, somando 48 mutantes de escape diferentes. A equipe também investigou se algum desses mutantes está presente em isolados humanos de SARS-CoV-2, compilando as sequências disponíveis do genoma do vírus e comparando-as com a sequência do genoma dos mutantes.Eles descobriram que 27 das 48 mutações estão circulando em humanos, sendo a mutação D614G a mais frequente, observada em 86% dos isolados.

 

Mais significativamente, a substituição em S477N, que conferiu uma resistência a algum nível em todos os mAbs, foi a segunda variante mais abundante nos isolados humanos.

 

A equipe do estudo observou algumas limitações do estudo. Embora o VSV seja um imitador eficaz do vírus SARS-CoV-2, 27 mutantes de escape foram encontrados apenas em isolados humanos do vírus. Eles também observam os poucos soros humanos testados. Mais amostras de soros humanos podem ajudar a determinar a extensão da neutralização e dos mutantes de escape presentes.

 

Mais importante ainda, a equipe do estudo alertou que, se tais variações no vírus surgirem após a vacinação, elas podem limitar a eficácia do tratamento.

 

A equipe do estudo disse: "A barreira genética relativamente baixa à resistência combinada com o conhecimento da presença de substituições relevantes em isolados clínicos sugere que a terapia eficaz com mAb provavelmente exigirá uma combinação de pelo menos dois anticorpos neutralizantes",

 

Determinando os resíduos resistentes a anticorpos específicos poderia ajudar a selecionar combinações com base em mutações resistentes não sobrepostas.

 

A equipe do estudo alerta que a comunidade internacional de pesquisa deve prestar atenção detalhada não apenas a essas mutações resistentes a anticorpos, mas também a mutações mais novas que emergem rapidamente na circulação predominante.

 

Também gostarímos de observar que parece haver um esforço concertado por parte das agências dos EUA como NIH, CDC FDA e até mesmo pela OMS e os vários gigantes farmacêuticos e biotecnológicos para ignorar ou minimizar todos esses emergentes SARS-CoV-2 variantes e cepas mutadas que são resistentes a anticorpos, apesar de muitas delas ganharem domínio na circulação. Infelizmente, como há trilhões de dólares em jogo em muitos desses programas terapêuticos de vacinas e anticorpos, a mídia, pesquisadores e periódicos médicos estão sendo comprados para minimizar o que poderia ser um desastre iminente, à medida que a pandemia COVID-19 evolui e deve permanecer até o próximos anos.

 

 

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