domingo, 8 de novembro de 2020

Drogas COVID-19: ácido 5-amino levulínico e etacridina identificados como inibidores potenciais da SARS-CoV-2 em dois estudos separados

 

Fonte: COVID-19 Drugs 08 de novembro de 2020

Medicamentos COVID-19 : Com a atual pandemia de COVID-19 em rápido escalonamento e sem medicamentos eficazes até o momento, pesquisadores em todo o mundo estão tentando desesperadamente encontrar candidatos a medicamentos adequados para explorar ainda mais sua eficácia contra o coronavírus SARS-CoV-2. Em dois estudos separados, foram identificados dois possíveis candidatos a drogas que demonstraram inibir o vírus SARS-CoV-2, sendo um deles o ácido 5-amino levulínico e o outro a etacridina.  


No primeiro estudo, pesquisadores japoneses da Universidade de Nagasaki testaram o ácido 5-amino levulínico in vitro em células derivadas de humanos e descobriram que ele previne a infecção por SARS-CoV-2. Por ser seguro e onipresente em plantas e animais, pode ser um potencial terapêutico contra a SARS-CoV-2.

 

Os resultados do estudo foram publicados em um servidor de pré-impressão e ainda precisam ser revisados ​​por pares. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.28.355305v1 O

 

ácido 5-amino levulínico (5-ALA) é um aminoácido natural, encontrado em plantas, animais, bactérias e fungos, e forma a protoporfirina IX (PPIX) quando oito moléculas se juntam. PPIX pode gerar heme quando combinado com um íon ferroso. O 5-ALA tem sido utilizado em várias terapias, como melhora metabólica, devido à sua capacidade de melhorar o metabolismo energético aeróbio e o diagnóstico e terapia de câncer usando um recurso fotossensível do PPIX.

Estudos recentes sugerem que o 5-ALA também tem propriedades antivirais contra patógenos humanos como o vírus da dengue, o vírus Zika e o SARS-CoV-2.

 

A fim de testar a potência dos compostos 5-ALA contra o SARS-CoV-2, a equipe do estudo isolou o vírus de um swab nasal de um paciente no Japão e propagou-o em células VeroE6. Eles quantificaram a infecção usando um ensaio de imunofluorescência que desenvolveram usando um anticorpo para a proteína N SARS-CoV-2.

 

A equipe descobriu que quando as células VeroE6 foram tratadas com 5-ALA por 72 horas antes da infecção, preveniu a infecção por SARS-CoV-2. No entanto, um tempo de pré-tratamento mais curto, de 48 horas, não evitou a infecção. Os autores descobriram que PPIX gradualmente se acumulou dentro das células. Pode ser por isso que existe um efeito dependente do tempo na inibição do vírus.

 

Curiosamente, adicionar citrato ferroso de sódio (SFC) junto com 5-ALA também ajudou a prevenir a infecção, mas apenas com 72 horas de pré-tratamento. Isso provavelmente ocorre porque o SFC fornece ferro para gerar heme, junto com 5-ALA.

 

Em seguida, a equipe de estudo testou o efeito antiviral do 5-ALA em células Caco-2 derivadas do cólon humano, que podem metabolizar o 5-ALA.

 

Os pesquisadores descobriram que o pré-tratamento de 72 e 48 horas, com e sem SFC, foi eficaz na prevenção do tratamento. Isso indica que o 5-ALA tem efeitos antivirais em humanos.

 

A equipe do estudo descobriu que o IC50, que é a quantidade de uma droga necessária para inibir um processo biológico em 50%, para inibir a infecção por SARS-CoV-2 em células VeroE6 usando 5-ALA era de 570 mm sem SFC e 695 mm com SFC .

 

Significativamente, o efeito antiviral foi muito mais poderoso em células humanas, com o IC50 sendo de 39 mm e 63 mm com e sem SFC, respectivamente. Os autores também testaram se o composto era tóxico e descobriram que o 5-ALA não era tóxico para células até uma concentração de 2.000 mm. A equipe do estudo sugere que uma estrutura G-quadruplex (G4) pode ser um alvo potencial dos antivirais, e os compostos que se ligam a ela podem inibir a infecção por SARS-CoV-2. G4 é uma estrutura tetrahélica formada por regiões ricas em guanina de DNA ou RNA. Também é encontrado em  coronavírus  e pode afetar a replicação do vírus. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29554280/ https://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.1006675

 

 

 

 

Muitos coronavírus têm um domínio de ligação G4 na proteína não estrutural 3 (Nsp3), que é essencial na transcrição do genoma.

 

A partir de estudos anteriores, descobriu-se que o genoma do SARS-CoV-2 também tem estruturas G4 com um motivo semelhante ao macrodomínio (SUD) do SARS em sua proteína Nsp3. Portanto, é provável que as interações de G4 com proteínas de ligação possam ser um alvo potencial para drogas antivirais. https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1000428

 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4567502/

 

Além disso, heme, um 5- O metabólito do ALA é conhecido por complexar com as estruturas G4. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32329781/






ácido 5-amino levulínico inibe a infecção por SARS-CoV-2 in vitro

 

O autor correspondente do chumbo cum, Professor Dr. Yasuteru Sakurai do departamento de Doenças Infecciosas Emergentes, Instituto de Medicina Tropical (NEKKEN), Universidade de Nagasaki, disse: "Suplementação exógena de 5-ALA induz aumento na geração de PPIX e heme dentro das células hospedeiras, potencialmente interferindo na interação das estruturas G4 no hospedeiro ou genoma viral com a proteína viral Nsp3 ou proteínas de ligação do hospedeiro G4, que inibe a infecção por SARS-CoV-2. ”

 

Como o 5-ALA é feito na maioria das plantas e animais, e os humanos o consomem rotineiramente na alimentação, é seguro para ser usado pela população em geral. Devido à sua alta biodisponibilidade, pode ser facilmente tomado por via oral. O 5-ALA também apresenta efeitos antiinflamatórios, o que pode ser outra vantagem do composto.

 

Além disso, o uso de 5-ALA pode fornecer outra opção para o tratamento e prevenção da infecção por SARS-CoV-2, sendo uma classe de medicamentos diferente daqueles atualmente em uso ou testados. Testes adicionais em modelos animais podem ajudar no avanço do uso de 5-ALA em tratamentos.

 

Etacridina identificada como potencial inibidor de SARS-CoV-2

 

No segundo estudo, cientistas da University of California-San Francisco e da Stanford University-California relataram um anti-séptico potente e seguro para uso em humanos chamado etacridina, que efetivamente inibe SARS-CoV- 2 mesmo em concentrações muito baixas de EC50 ~ 0,08 µM.

 

Os resultados do estudo também foram publicados em um servidor de pré-impressão e ainda precisam ser revisados ​​por pares. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.28.359042v1

 

O candidato a medicamento etacridina foi identificado por meio de uma triagem de alto rendimento de uma biblioteca de medicamentos aprovada pelo FDA em células vivas com a ajuda de um ensaio fluorescente.

 

Para identificar drogas que inibem o vírus SARS-CoV-2, a equipe de estudo redesenhou a proteína fluorescente verde (GFP) em um repórter de atividade de Mpro que se torna fluorescente na clivagem pelo Mpro ativo. Usando esse ensaio fluorescente, eles identificaram muitos medicamentos que inibem a atividade de Mpro, e o mais eficaz deles foi a etacridina, que inibe a produção de SARS-CoV-2 por meio da inativação das partículas virais.



Demonstração de um repórter de atividade baseado em GFP da protease principal Mpro da SARS-CoV2. (a) Esquema do relator. (b) Sequência do GFP10-11 invertido. (c) Construção do repórter FlipGFPMpro. (d) Imagens de fluorescência (esquerda) e análise quantitativa (direita) de SARS-CoV-2 ou células HEK293T com infecção simulada que coexpressaram hACE2. As imagens no canal FlipGFP foram iluminadas 30 vezes em comparação com aquelas em (e). (e) Imagens de fluorescência de células HEK293T que expressam FlipGFPMpro e mCherry, juntamente com o mutante C145A inativo Mpro (painéis superiores) ou Mpro de tipo selvagem (painéis inferiores). (f) Fluorescência FlipGFP normalizada por mCherry. A proporção de FlipGFP / mCherry para Mpro / C145A é normalizada para 1. Os dados são a média ± SD (n = 5). FlipGFPTEV é um repórter de atividade TEV contendo sequência de clivagem TEV em FlipGFP. Barra de escala: 5 μm (d); 10 μm (f).

 

Verificou-se que a etacridina bloqueia o SARS-CoV-2 em linhas de células humanas e não é citotóxico em modelos animais.

 

Os resultados da pesquisa mostram uma nova abordagem contra o SARS-CoV-2 que inativa as partículas virais, e espera-se que a eficácia dessa abordagem seja independente do tipo de célula. A etacridina demonstrou bloquear o SARS-CoV-2 nas células da linha celular humana A549ACE2 e nas células HNE primárias. Além disso, não foi tóxico em modelos animais, incluindo camundongos, ratos e coelhos.

 

Curiosamente, verificou-se que a etacridina tem uma potência antiviral mais forte em comparação com o remdesivir e também tem muito pouca toxicidade celular. Outros medicamentos identificados por este estudo mostram uma faixa IC50 semelhante na inibição de Mpro e EC50 contra o vírus SARS-CoV-2.

 

A etacridina, no entanto, mostrou potência antiviral muito maior de EC50 ~ 0,08 μM do que a atividade de inibição de Mpro (IC50 ~ 3,5 μM). Isso mostra que a principal ação da etacridina não é a inibição da Mpro.

 

O autor correspondente, Dr. Raul Andino do departamento de microbiologia e imunologia da University of California-San Francisco, disse à Thailand Medical News: "Nossas descobertas revelam uma nova abordagem contra a SARS-CoV-2 via partículas virais inativadoras, cuja eficácia é esperada ser independente do tipo de célula. "

 

Verificou-se que a etacridina inativa as partículas virais sem afetar a replicação do vírus.

 

A equipe do estudo afirma que seu trabalho identificou uma droga poderosa com um claro modo de ação contra o vírus SARS-CoV-2, pois a etacridina inativa as partículas virais e, assim, impede a ligação às células hospedeiras. O trabalho também fornece evidência direta de partículas SARS-CoV-2 perdendo sua infecciosidade e capacidade de se ligar às células hospedeiras após o tratamento com etacridina.

 

Além disso, os dados de qRT-PCR mostram que a etacridina não afeta a replicação do RNA viral. Assim, os resultados sugerem que a etacridina bloqueia o vírus SARS-CoV-2 principalmente por inativar as partículas virais sem afetar a replicação do vírus. A investigação adicional focou nas mudanças ultraestruturais nas partículas virais e na ligação da etacridina ao RNA ou à proteína viral para entender como a etacridina inativa o vírus.

 

O Dr. Andino acrescentou: "Os mecanismos detalhados de como a etacridina inativa as partículas virais exigirá mais investigação, como possíveis alterações ultraestruturais das partículas virais e a ligação da etacridina ao RNA ou proteína viral".

 

Atualmente, a etacridina é usada como desinfetante tópico, mas já é usada no tratamento de pacientes com sepse puerperal por injeção intravenosa. Assim, seu efeito antiviral pode ser facilmente validado em modelos animais, bem como em pacientes com COVID-19. Além disso, uma vez que inativa diretamente as partículas do vírus SARS-CoV-2, a etacridina pode ser combinada com drogas como o remdesivir, o inibidor da replicase, para tratar pacientes com COVID-19 e melhorar seus resultados clínicos.

 

A equipe do estudo comentou: "Embora atualmente a etacridina seja usada principalmente como desinfetante tópico de feridas, ela tem sido aplicada em pacientes para o tratamento da sepse puerperal por meio de injeção intravenosa".

 

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